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Ricevuto 19 Novembre 2012; Rivisto 4 gennaio, 2013; Accettato 9 gennaio 2013 Editor Accademico: Youn Chul Kim Copyright © 2013 Hemant Kumar et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto la Creative Commons Attribution License. che consente l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'opera originale sia correttamente citato. astratto Gastrodia elata (GE) Blume è uno dei più importanti impianti tradizionali nei paesi orientali ed è stato usato per secoli per migliorare le varie condizioni. Il gastrodin fenolica glucoside è un componente attivo di GE. Lo scopo di questo studio è stato quello di indagare il ruolo neuroprotettivo di gastrodin in 1-metil-4-phenylpyridinium (MPP +) / 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahydropyridine - (MPTP) indotta dopaminergico umana cellule SH-SY5Y e modello murino di Parkinson & # x2019; s malattia (PD), rispettivamente. Gastrodin in modo significativo e dose dipendente neuroni dopaminergici protetti contro neurotossicità attraverso la regolazione dei radicali liberi, Bax / Bcl-2 mRNA, caspasi-3, e poli spaccati (ADP-ribosio) polimerasi (PARP) nelle cellule SH-SY5Y sottolineato con MPP +. Gastrodin anche mostrato effetti neuroprotettivi nel modello MPTP PD del mouse subcronica da ameliorating bradicinesia e disabilità motoria nelle prove pole e rotarod, rispettivamente. Coerentemente con questa constatazione, gastrodin impedito deplezione di dopamina e ridotto astrogliosis reattiva causata da MPTP come valutato dal immunoistochimica e immunoblotting nel Nigrae substantiae e striatata di topi. Inoltre, gastrodin era anche efficace nel prevenire l'apoptosi neuronale attenuando attività antiossidante e antiapoptotiche in queste aree cerebrali. Questi risultati suggeriscono fortemente che gastrodin ha effetti protettivi nei modelli sperimentali PD e che può essere sviluppato come un candidato clinico per migliorare i sintomi PD. 1. Introduzione Parkinson & # x2019; s malattia (PD) è malattia neurodegenerativa caratterizzata da progressiva perdita di neuroni dopaminergici nella pars compacta della substantia nigra (SNPC), che porta a sintomi clinici di rigidità, tremore a riposo, e bradicinesia [1. 2]. 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina (MPTP) è un complesso mitocondriale conosciuto io inibitore che selettivamente danneggia i neuroni dopaminergici nella SNPC e porta alla deplezione di dopamina nello striato con conseguente sindrome parkinsoniana [ 1. 3. 4]. Dopo la somministrazione parenterale, MPTP entra nel cervello e viene metabolizzato a 1-metil-4-phenylpyridinium (MPP +) da monoamino ossidasi-B, che induce la morte cellulare neuronale [5]. Il modello MPTP subcronico del mouse è piuttosto un regime popolare, in quanto provoca l'apoptosi e impoverisce striatale della dopamina del 40 & # x2013; 50 & # x25; nei giovani adulti C57BL / 6 topi, e lesioni dopaminergici stabilizzare entro 21 giorni dopo la somministrazione di MPTP [6. 7]. cellule SH-SY5Y dopaminergici umani possiedono molte delle qualità di neuroni umane e, come tali, sono serviti da modello PD consolidata [8. 9]. Le droghe sintetiche causano effetti avversi indesiderati, mentre i prodotti naturali sono considerati sicuri ed efficaci. Erbe medicinali stanno diventando popolari per il miglioramento della qualità della vita con limitate o senza effetti collaterali [10]. L'influenza di prodotti naturali molto marcata nella scoperta di nuovi farmaci. Di 1.335 farmaci approvati dal 1940 ad oggi, 59 (4 & # x25;) sono stati derivati da prodotti naturali, e 299 (22 & # x25;) sono stati derivati da un prodotto naturale (modifica semisintetico) [11]. Il gastrodin fenolica glucoside è un componente attivo di Gastrodia elata Blume (Orchidaceae) ed è uno dei più importanti impianti tradizionali nei paesi orientali. Gastrodin è stato utilizzato per il trattamento di vari disturbi come mal di testa, capogiri, vertigini, e le malattie convulsive nella medicina tradizionale. Oltre ai reclami tradizionali, relazioni scientifiche supportano l'antiossidante [12. 13], anticonvulsivante [14], anti-infiammatori [15 & # x2013; 17], antiepilettico [18], antiobesità [19], ansiolitico [20], e di apprendimento e memoria miglioramenti [21. 22] in attività di gastrodin. Gastrodin attenua in modo significativo i livelli di espressione di mediatori proinfiammatori neurotossici, tra cui ossido nitrico sintasi inducibile, cicloossigenasi-2, e il pro-infiammatorio citochine tumor necrosis factor-& # x3b1; e l'interleuchina-1 & # x3b2; in cellule microgliali lipopolisaccaride stimolata [17. 23]. Gastrodin è anche un potente antiossidante e scavenger di radicali liberi che diminuisce i livelli di perossidazione lipidica [24] e aumenta l'espressione di geni che codificano proteine antiossidanti [25]. Inoltre, gastrodin è stato utilizzato in cliniche come farmaco efficace e sicuro per prevenire il declino neurocognitivo seguente bypass cardiopolmonare [26] ed è vantaggioso per i pazienti anziani con ipertensione refrattaria migliorando l'equilibrio dell'endotelina e ossido nitrico nel plasma [27], suggerendo uso sicuro negli esseri umani. Tuttavia, gli studi valutare il ruolo neuroprotettivo di gastrodin in modelli sperimentali MPP + / MPTP PD non sono stati condotti. Nel presente studio, abbiamo chiarito il meccanismo neuroprotettivo probabile gastrodin utilizzando in vitro e in vivo modelli sperimentali di PD. cellule SH-SY5Y sono stati trattati con 1 & # x2009; mM MPP + e / o gastrodin (1, 5, 25 e & # x2009; & # x3bc; M) e valutati per i cambiamenti nella morfologia cellulare e la vitalità delle cellule. Noi antiossidanti ulteriormente caratterizzato (specie reattive dell'ossigeno (ROS) inibizione, superossido dismutasi (SOD) di attività) e antiapoptotiche attività (Bax / Bcl-2 mRNA, caspasi-3, e spaccati PARP) in cellule SH-SY5Y sottolineato con MPP + per chiarire gli effetti neuroprotettivi di gastrodin. Inoltre, abbiamo usato MPTP-intossicato C57BL 6 topi / e poi eseguito comportamentale (palo e test rotarod), antiossidanti (SOD, eme ossigenasi-1 (HO-1)), istochimiche (tirosina idrossilasi (TH) e proteina fibrillare acida della glia (GFAP)), e polimerasi valutazioni histobiological (Bax, Bcl-2, poli spaccati (ADP-ribosio) (PARP), e l'attività della caspasi-3). Gli attuali risultati rivelano gastrodin come un potenziale candidato con attività neuroprotettiva e antiapoptotiche e fortemente suggeriscono gastrodin come candidato clinico per PD. 2. Materiali e metodi 2.1. reagenti Gastrodin è stato acquistato da PHYTOLAB (Vestenbergsgreuth, Germania). MPP +. MPTP, 2,2-azobis (2-amidinopropane) cloridrato (AAPH), 1,1-difenil-2-picrylhydrazyl (DPPH), (4-piridil-1-ossido) - N-tert-butylnitrone, 3- (3 , 4-dimetiltiazolo-2-il) bromuro di -2,5-difenil-tetrazolio (MTT), e un kit di test di caspasi-3 sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Il buffer 10x RIPA è stato ottenuto da Millipore (Milford, MA, USA). Gli inibitori della proteasi e inibitori della fosfatasi compresse da cocktail sono stati forniti dalla Roche (Roche, Indianapolis, IN, USA). Tween 80 è stato acquistato da Merck (Calbiochem, Darmstadt, Germania). piastre sei pozzetti e 96 pozzetti di coltura tissutale e 100 & # x2009; piatti della cultura mm sono stati acquistati da Nunc Inc. (Aurora, IL, USA). Dulbecco & # x2019; s Modified Eagle & # x2019; s media (DMEM) e siero fetale bovino (FBS) sono stati acquistati da Gibco-BRL Technologies (Carlsbad, CA, USA). Tutti gli altri prodotti chimici utilizzati in questo studio erano di grado analitico e sono stati ottenuti da Sigma Chemical Co. 2.2. Colture cellulari e trattamenti cellule SH-SY5Y dopaminergici umani sono stati ottenuti dalla American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) e coltivate in DMEM supplementato con 10 & # x25; (V / v) inattivato FBS, e 100 & # x2009; U / mL di penicillina / streptomicina. Le cellule sono state mantenute a 37 & # xb0; C a 5 & # x25; CO 2 e un 95 & # x25; incubatore aria umidificata per il tempo indicato. Tutti gli esperimenti sono stati effettuati 24 & # x2013; 48 & # x2009; ore dopo le cellule sono state seminate. Le cellule sono state pretrattate con varie concentrazioni (1, 5, e 25 e # x2009; & # x3bc; M) di gastrodin per 4 & # x2009; h prima incubazione in un mezzo contenente 1 & # x2009; mM MPP +. Le cellule di controllo sono stati trattati con lo stesso mezzo senza farmaci. 2.3. Animali e Trattamenti Sei settimane di età C57BL maschio / 6 topi sono stati ottenuti da Samtako Bio Korea (Gyeonggi-do, Corea) e acclimatati prima dell'uso. Mouse & # x7e; 8 settimane di età e 25 & # x2013; 28 & # x2009; g di peso sono stati utilizzati in questo studio. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con i principi di Laboratorio Animal Care (NIH pubblicazione n. 85-23, rivisto 1985) e linee guida per gli esperimenti sugli animali a Konkuk University. Gli animali sono stati alloggiati in un ambiente controllato ( umidità) e ha permesso libitum cibo e acqua ad. Le luci della stanza erano tra le 8: 00 & # x2009; he 20: 00 & # x2009; h; sessanta animali sono stati divisi in cinque gruppi contenenti 12 animali ciascuno. I gruppi inclusi veicolo, MPTP, 10 & # x2009; mg / kg gastrodin, 30 & # x2009; mg / kg gastrodin, e 60 & # x2009; mg / kg gastrodin. Gastrodin è stato somministrato perorally per 15 giorni presso le rispettive dosi, e MPTP è stato somministrato per via intraperitoneale per gli ultimi 5 giorni di trattamento gastrodin. Tutti i gruppi eccetto il gruppo veicolo ricevuto un'iniezione di 30 & # x2009; mg / kg / giorno per 5 giorni MPTP. MPTP e gastrodin sono stati sciolti in soluzione fisiologica e preparate appena prima del dosaggio. 2.4. Valutazione della vitalità cellulare La vitalità cellulare è stata misurata usando il saggio MTT colorimetrica quantitativa, che rivela l'attività dei mitocondri delle cellule viventi, come descritto in precedenza [28]. MTT disciolto in PBS è stato aggiunto alla fine dell'incubazione ad una concentrazione finale di 0,5 & # x2009; mg / mL. Dopo 4 & # x2009; h di incubazione a 37 & # xb0; C e 5 & # x25; CO 2. i supernatanti sono stati rimossi, e i cristalli formazano formati nelle cellule vitali sono stati misurati a 550 nm usando un lettore per micropiastre (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). 2.5. Misura di Free Radical Scavenging Attività, intracellulare Reactive Oxygen Species (ROS), e superossido dismutasi (SOD) Attività attività di lavaggio del radicale libero è stata valutata utilizzando una risonanza di spin elettronico (ESR) spettrofotometro (JEOL, Tokyo, Giappone). DPPH attività antiradicalica è stata misurata utilizzando un metodo precedentemente descritto [29]. Una soluzione campione di gastrodin è stato aggiunto al 60 & # x2009; & # X3bc; M DPPH in metanolo e incubata per 2 & # x2009; min. radicali alchilici sono stati generati da AAPH. La miscela di reazione, contenente 10 & # x2009; mM AAPH, 10 & # x2009; mM 4 POBN e gastrodin di varie concentrazioni in PBS (pH 7,4), è stata incubata a 37 & # xb0; C in un bagno d'acqua per 30 & # x2009; min. I radicali ossidrile sono stati generati dalla reazione di Haber-Weiss ferro-catalizzata (Fenton-driven reazione di Haber-Weiss), e i radicali idrossili generati hanno reagito rapidamente con nitrone spin-trappola DMPO. La miscela di reazione, contenente 0,3 & # x2009; M DMPO, 10 & # x2009; mM FeSO 4. 10 & # x2009; mm H 2 O 2. e varie concentrazioni di gastrodin in PBS (pH 7,2), è stata incubata per 2,5 & # x2009; min. radicali superossido sono stati generati da un sistema di riboflavina / EDTA UV-irradiato. La miscela di reazione, contenente 0,8 & # x2009; mM riboflavina, 1,6 & # x2009; mM EDTA, 0,8 & # x2009; M DMPO, e varie concentrazioni di gastrodin, è stato irradiato per 1 & # x2009; min sotto una lampada UV a 365 e # x2009; nm. Lo spettro ESR è stato registrato per ogni radicale usando uno spettrometro ESR. La produzione di ROS intracellulare è stata misurata utilizzando un nonfluorescent composto di 2 & # x2032;, 7 & # x2032; diacetato - diclorofluoresceina (DCFH-DA) nelle cellule SH-SY5Y. Misura la formazione di perossido di idrogeno generato da una raffica metabolico ossidativo. cellule vitali possono deacetylate DCFH-DA per 2 & # x2032;, 7 & # x2032; - diclorofluoresceina (DCFH), che non è fluorescente. Questo composto reagisce quantitativamente con le specie di ossigeno all'interno della cellula per produrre un colorante fluorescente 2 & # x2032;, 7 & # x2032; - diclorofluoresceina (DCF), che rimane intrappolato all'interno della cellula e può essere misurata per fornire un indice di livello di ROS. Dopo il trattamento farmacologico, le colture sono state lavate con PBS, caricato con 20 & # x2009; & # X3bc; M DCF-DA per 30 & # x2009; min a 37 & # xb0, C, e poi lavato di nuovo con PBS. DCF fluorescenza è stato analizzato utilizzando un lettore di piastre a fluorescenza (Spectramax M2e, Molecular Devices) a eccitazione ed emissione lunghezze d'onda di 490 e 530 & # x2009; nm. SOD è stata misurata come ulteriore indicatore di variazione meccanismo ossidativo dopo il trattamento (s) in cellule SH-SY5Y e lisato tissutale. SOD è stata determinata utilizzando il kit chimico Cayman (Ann Arbor, MI, USA) secondo il produttore & # x2019; s istruzioni. 2.6. Behavioral Testing: Pole e rotarod Test Il test poli per bradicinesia è stata condotta utilizzando una modifica del metodo precedentemente riportato [30]. I topi sono stati posizionati con la testa fino alla sommità di un palo a superficie ruvida (8 & # x2009; mm di diametro e 55 & # x2009; cm di altezza), e T-turn e attività locomotoria totale (TLA) sono stati misurati. Il T-turn è il tempo che l'animale serve per trasformare completamente il suo lato negativo volto. TLA è il tempo fino mouse arriva sul pavimento. La durata di questi parametri riflette bradicinesia. Questo test è stato eseguito cinque volte in successione per ogni mouse, e la media è stata presa per l'analisi. Il test rotarod stata eseguita come descritto in precedenza [31] con lievi modifiche. Una settimana dopo l'ultima iniezione di MPTP, le prestazioni rotarod è stata valutata sull'asta sospensione di un apparato rotarod accelerazione (diametro: 3 & # x2009; cm) che accelera ad una velocità costante da 1 a 30 & # x2009; rpm per 300 & # x2009; s . I topi sono stati addestrati per 3 giorni consecutivi, e sono stati immessi sul bastone per cinque prove. Il tempo è stato registrato per ogni prova. Un processo si è concluso quando il mouse è caduto il rotarod o dopo il tempo ha raggiunto i 300 & # x2009; s. Un tempo di riposo di 180 & # x2009; s è stato consentito tra ogni prova. 2.7. immunoistochimica I topi sono stati anestetizzati con sodio pentobarbital (50 & # x2009; mg / kg, per via intraperitoneale) dopo aver eseguito gli esperimenti comportamentali e loro cervelli sono stati perfusione-fissato con 4 & # x25; paraformaldeide in 0.1 & # x2009; tampone fosfato M (pH 7.4) a seguito di una soluzione salina come descritto in precedenza [6]. I cervelli sono stati rimossi dopo fissazione perfusione a 4 e # xb0; C e immerse nello stesso fissativo e disidratato in 30 & # x25; soluzione di saccarosio fino a quando non sono stati incorporati nei tessuti congelamento medio (Leica, Gmbh Heidelberger, Germania). Le sezioni congelate (30 & # x2009; & # x3bc; M) dello striato e SNPC sono stati utilizzati per immunoistochimica, come descritto in precedenza [32]. Gli anticorpi primari utilizzati per la TH e GFAP erano anticorpi di coniglio anti-TH (1 & # x2009;: & # x2009; 1000; Calbiochem San Diego, CA, USA) e un anticorpo policlonale di coniglio al GFAP (1 & # x2009;: & # x2009; 5000; Abcam, Cambridge, UK), rispettivamente. Le sezioni di immunoistochimica TH sono state incubate con biotinilato anti-coniglio (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) anticorpo per 1 & # x2009; h, seguita da incubazione nel complesso Kit Vectastain Elite ABC avidina-biotina-perossidasi (Vector Laboratories) per 60 & # x2009; minuti a temperatura ambiente, a seconda del fornitore & # x2019; s raccomandazioni. Infine, le sezioni hanno reagito con il kit substrato vettore DAB (Vector Laboratories) per lo sviluppo del colore. Le sezioni GFAP sono state incubate con anticorpi di coniglio antigoat GFAP (1 & # x2009;: & # x2009; 200) (Alexa Farina 488, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) per 1 & # x2009; h. cellule colorate sono state viste sotto un microscopio a campo luminoso (Carl Zeiss Inc. Oberkochen, Germania). 2.8. Analisi immunoblot A 0.1 & # x2009; mL aliquota di tampone RIPA (1x PBS, 1 & # x25; NP-40, 0,5 & # x25; sodio desossicolato, 0,1 & # x25; SDS contenente appena aggiunto cocktail inibitore della proteasi (Calbiochem)) è stato aggiunto al cellule coltivate in 100 & # x2009; mm piastre per ottenere il lisato cellulare totale. Le cellule sono state raschiate, incubate per 10 & # x2009; min in ghiaccio, e centrifugati a 14.000 & # x2009; & # XD7; rpm per 10 & # x2009; min a 4 & # xb0; C. Per l'esperimento animale, i tessuti sono stati lavati due volte con PBS, posta a 4 & # xb0, C, e omogeneizzati con un 1 & # x2009; mL siringa in tampone di lisi (1x RIPA tampone di lisi, cocktail inibitore della proteasi e inibitori della fosfatasi cocktail) e poi finalmente passata attraverso un ago da siringa 31 1/2 calibro e centrifugati a 14.000 & # x2009; rpm a 4 & # xb0; C per 15 & # x2009; min. I supernatanti sono stati raccolti per ulteriori analisi. La concentrazione proteica è stata determinata dalla Bio-Rad DC Protein Assay (Hercules, CA, USA). 15 & # x2009; & # X3bc; g di lisati cellulari (interi esperimenti sulle cellule) o 40 & # x2009; & # X3bc; g di proteine (esperimenti su animali) sono stati separati per elettroforesi del 10 & # x25; sodio dodecil solfato elettroforesi-poliacrilammide (SDS-PAGE), e le proteine risolte sono state trasferite a membrane polivinildenfluoruro (Millipore, Bedford, MA, USA). Le membrane sono state incubate per 1 & # x2009; h con 5 & # x25; latte scremato in tampone PBS per bloccare legame aspecifico e poi incubate con anticorpi primari anti-TH, anti-PARP (1 & # x2009;: x2009 & #; 1000; Cell Signaling Technology), anti-GFAP (1 & # x2009;: & # x2009; 30.000; Abcam), anti-HO-1 (1 & # x2009;: & # x2009; 1000; Stressgen biotecnologie), e anti-& # x3b2; actina (1 & # x2009;: & # x2009; 2000; Cell Signaling Technology). Le macchie sono state visualizzate utilizzando il SuperSignal occidentale Pico Substrato Chemiluminescente Detection System (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA), secondo il costruttore & # x2019; s procedura. Le densità ottica delle bande specifiche di anticorpi sono stati analizzati utilizzando un luminescenti immagine analizzatore, LAS-3000 (Fuji, Tokyo, Giappone). 2.9. L'RNA totale Estrazione e trascrizione inversa della polimerasi Chain Reaction (RT-PCR) cellule / pozzetto) sono state coltivate in 6 pozzetti, e l'RNA totale è stato isolato mediante estrazione con TRIzol (Invitrogen). RNA totale è stato anche estratto dai tessuti mesencefalo e striatali utilizzando TRIzol reattivo per RT-PCR. Un totale di 2,5 & # x2009; & # X3bc; g di RNA totale è stato retrotrascritto utilizzando un kit di First Strand cDNA Synthesis (Invitrogen). PCR è stata effettuata utilizzando il cDNA sopra preparata come modello. GAPDH è stato utilizzato come controllo interno per valutare l'espressione relativa di HO-1, Bcl-2 e Bax. PCR è stata condotta utilizzando primer specifici (Bioneer, Daejeon, Corea), come riportato in precedenza [32]. Le sequenze di primer sono riportati nella Tabella supplementare 1 del supplementare materiale disponibile online all'indirizzo http://dx. doi. org/10.1155/2013/514095. 2.10. Assay caspasi-3 Attività Caspasi-3 attività è stata rilevata con un colorimetrico caspasi-3 Kit Assay (Sigma-Aldrich), secondo il costruttore & # x2019; s protocollo. Brevemente, la miscela di reazione (volume totale, 200 & # x2009; & # x3bc; L) conteneva 5 & # x2009; & # X3bc; L di lisato cellulare / lisato tissutale e 5 & # x2009; & # X3bc; L di caspasi-3 substrato (Ac-DEVD-pNA; concentrazione finale, 200 & # x2009; & # x3bc; M) in tampone di saggio, e la prova è stata effettuata in una piastra da 96 pozzetti. Una miscela di reazione di controllo conteneva 5 & # x2009; & # X3bc; L di lisato cellulare e 5 & # x2009; & # X3bc; L dello specifico inibitore della caspasi-3 (Ac-DEVD-CHO; concentrazione finale, 20 & # x2009; & # x3bc; M) in tampone ed è stato usato per spiegare l'idrolisi non specifica del substrato. Entrambe le miscele sono state incubate per 90 & # x2009; min a 37 & # xb0, C, ed emissione ed eccitazione assorbanza lunghezze d'onda di 360 e 460 & # x2009; nm, rispettivamente. 2.11. Analisi statistiche Tutti i dati sono stati analizzati utilizzando Graph Pad Prism versione 5.01 (grafico Pad, Inc. La Jolla, CA, USA). Tutti i dati sono espressi come media & # xb1; errore standard di almeno tre esperimenti indipendenti effettuata in triplicato nel caso in vitro o esperimenti istologiche e histobiochemical. Il confronto di interesse per l'esperimento comportamentale è stato l'effetto di ogni trattamento rispetto ai topi di controllo e topi MPTP-intossicato contro gastrodin e MPTP topi intossicati. L'analisi statistica è stata effettuata con una analisi della varianza ad una via seguita da Tukey & # x2019; s test di confronto multiplo. Valori & # x3c; 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi. 3. Risultati 3.1. Gastrodin migliora Perdita MPP + indotta di neuronale delle cellule vitalità Il trattamento di cellule SH-SY5Y con 1 & # x2009; h ha provocato la morte delle cellule marcata come valutato dal saggio MTT; solo per un massimo di 48 & # x2009 mM MPP +. La vitalità cellulare è significativamente migliorata in modo dose-dipendente, quando le cellule sono state pretrattate con varie concentrazioni di gastrodin (1, 5, e 25 & # x2009; & # x3bc; M) per 4 & # x2009; h prima di aggiungere 1 & # x2009; mM MPP +. Gastrodin da solo non ha causato alcun citotossicità significativa. Quando la vitalità delle cellule in condizioni di assenza di siero è stato definito come 100 & # x25; la sopravvivenza, la vitalità delle cellule trattate con 1 & # x2009; mM MPP + è sceso a La vitalità delle cellule incubate con 1, 5, e 25 & # x2009; & # X3bc; M gastrodin era del controllo, rispettivamente (Figura 1 (A)). cellule SH-SY5Y trattati per 48 & # x2009; h con 1 & # x2009; mM MPP + ha mostrato cambiamenti morfologici normalmente associati con la morte delle cellule, come il restringimento delle cellule e per eccesso di corpi cellulari (Figura 1 (B)). Le MPP + cambiamenti - indotta della morfologia delle cellule sono stati attenuati dalla gastrodin. Le cellule non hanno mostrato cambiamenti morfologici quando vengono trattati con gastrodin solo. Figura 1: Effetto di gastrodin su MPP + indotta neurotossicità nella linea cellulare SH-SY5Y dopaminergica neuroblastoma. Le cellule sono state esposte a gastrodin e 1 & # x2009; mM MPP + per il 48 & # x2009; h. La vitalità cellulare (A) e la morfologia delle cellule SH-SY5Y (B) dopo il trattamento con il controllo (a), 1 & # x2009; mM MPP + (B), 25 & # x2009; & # X3bc; M gastrodin (c), 25 e # x2009; & # X3bc; M gastrodin + 1 & # x2009; mM MPP + (d), 5 & # x2009; & # X3bc; M gastrodin + 1 & # x2009; mM MPP + (e), e 1 & # x2009; & # X3bc; M gastrodin + 1 & # x2009; mM MPP + (f). I dati sono percentuali dei valori delle colture di controllo non trattati e sono mezzi & # xb1; errori standard di tre esperimenti indipendenti in triplice copia. rispetto al gruppo di controllo, e confrontato con il MPP + gruppo - treated (analisi della varianza ad una via seguita da Tukey & # x2019; s test post hoc). 3.2. Attività antiossidante del Gastrodin Il potenziale di gastrodin per placare i radicali liberi, come DPPH, alchil, idrossile, e radicali superossido è stata studiata usando la spettroscopia ESR. DPPH è un radicale libero stabile, accetta un elettrone o idrogeno radicale diventare una molecola diamagnetico stabile, ed è stato utilizzato per valutare libera attività antiradicalica di antiossidanti naturali. La capacità di gastrodin per pulire DPPH è stata misurata mediante spettrometria ESR. DPPH radicali scavenging di gastrodin aumentata in modo dose-dipendente con una IC50 valore & # x2009; mg / ml (Figura 2 (a)). Il alchil radicale rotazione addotto del 4 POBN / radicale libero è stata generata da AAPH a 37 & # xb0; C per 30 & # x2009; min, e una diminuzione dei segnali ESR è stata osservata con dosi crescenti gastrodin. Alchil radicale attività di scavenging di gastrodin (0.25, 0.5, 1, 2 e & # x2009; mg / mL) era 22.96 & # x25 ;, 53.81 & # x25 ;, 71.36 & # x25 ;, e 83.51 & # x25 ;,, rispettivamente, con una IC50 valore & # x2009; mg / ml (Figura 2 (b)). Gastrodin prodotto un debole effetto scavenging non significativo sulla ossidrile e radicali superossido (dati non mostrati). Questi risultati forniscono prove certe degli effetti antiossidanti significativi di gastrodin, in particolare su DPPH e attività scavenging radicali alchilici. Abbiamo misurato la generazione di ROS in 1 & # x2009; cellule - treated mM MPP + mediante l'analisi fluorimetrica utilizzando DCFH-DA. Cellule esposte a MPP + visualizzati un manifesto incremento DCF fluorescenza a tempo dipendente rispetto alle colture di controllo. La fluorescenza DCF in cellule esposte a 1 e # x2009; mM MPP + a 24 & # x2009; h era superiore a quello del gruppo di controllo. Tuttavia, il trattamento con gastrodin effettivamente ridotto la generazione di ROS e gli effetti sopprimono rafforzata con l'aumento della concentrazione di gastrodin (figura 2 (c)). Inoltre, abbiamo studiato l'attività SOD in MPP modello + / MPTP nella cella e mouse SH-SY5Y, rispettivamente. MPP + / MPTP visualizzata perturbazioni nelle attività di SOD. Pretrattamento con gastrodin aumentata attività della SOD nelle cellule SH-SY5Y (Figura 2 (d)), striato (figura 2 (e)), e SNPC (Figura 2 (f)). Figura 2: Effetto del gastrodin su DPPH (a) e alchil (b) attività di scavenging radicali liberi. Gastrodin impedito la generazione di ROS in 1 & # x2009; mM MPP + - treated cellule SH-SY5Y come misurato mediante analisi fluorimetrica utilizzando DCFH-DA (c). Gastrodin aumentata l'MPP + - e perturbazione MPTP indotta a superossido dismutasi (SOD) l'attività in cellule SH-SY5Y (d), striato (e), e SNPC (F), rispettivamente. I dati sono percentuali dei valori delle colture di controllo non trattati e sono mezzi & # xb1; errori standard di tre esperimenti indipendenti in triplice copia. rispetto al gruppo di controllo. e confrontato con il MPP + gruppo - treated (analisi della varianza ad una via seguita da Tukey & # x2019; s test post hoc). 3.3. Gastrodin Attenua neurodegenerazione MPTP-indotta: TH e GFAP Immunoblots ed immunoistochimica TH, un marker di attività della dopamina e GFAP, una proteina marker astrociti, sono stati valutati. La proteina GFAP gioca un ruolo importante nelle interazioni di astrociti con altre cellule necessarie per la formazione e il mantenimento della mielina. Inoltre, GFAP può aiutare a mantenere la barriera emato-encefalica protettiva che può essere attraversato solo da alcuni soluti di 50 & # x2013; 52 & # x2009; kDa [33]. A causa di questi fattori, GFAP ha ricevuto molta attenzione come una proposta di biomarker in studio di malattie del sistema nervoso centrale [34. 35]. La densità degli astrociti GFAP-positivi aumenta in modo significativo ed è correlato negativamente con la gravità della deplezione di dopamina neurone [36]. Gastrodin restaurato diminuita o aumentata espressione di rispettivamente TH e GFAP, in topi MPTP-intossicati (Figura 3 (a)). Inoltre, questi risultati sono riflesse anche in analisi immunoblot, e gastrodin è risultato essere efficace nel ripristinare livelli TH (figure 3 (b) e 3 (c)) e l'espressione di GFAP (figure 3 (d) e 3 (e)) in SNPC e striato, rispettivamente. Figura 3: effetti protettivi di gastrodin contro MPTP nelle compacta pars del mouse sostanza nera (SNPC) e striato. Gastrodin è stato somministrato per 15 giorni presso le rispettive dosi, e MPTP è stato somministrato per gli ultimi 5 giorni di trattamento gastrodin. Tutti i gruppi ad eccezione del gruppo di veicoli hanno ricevuto iniezioni di 30 & # x2009; mg / kg / die per 5 giorni MPTP. I topi sono stati anestetizzati per lo studio immunoistochimico 7 giorni dopo MPTP intossicazione e dopo l'esecuzione dell'esperimento comportamentale. Proteina silicea fibrillare gliale (GFAP) immunofluorescenza ed immunoistochimica per la tirosina idrossilasi (TH) sono stati eseguiti nel SNPC e striato (a). Gastrodin protetti contro variazioni di TH e l'espressione di GFAP nel SNPC ((B) e (d)) e striato ((c) ed (e)) dopo MPTP intossicazione. livelli di proteina TH e GFAP nel SNPC e striato sono stati valutati mediante analisi Western Blot. I grafici a barre mostrano dati quantitativi per i segnali TH e GFAP che sono normalizzati al & # x3b2; segnale di actina ( = 4-5 per gruppo). I valori sono media & # xb1; errore standard (. vs gruppo veicolo) e (. e versus gruppo MPTP). 3.4. Gastrodin influisce Bcl-2 e Bax Espressione e Sopprime MPP + / MPTP Induced caspasi-3 attivazione Uno dei principali meccanismi coinvolti nell'induzione della via apoptotica mitocondriale è una diminuzione Bcl-2 livelli o, in alternativa, un aumento dei livelli di Bax. La famiglia di Bcl-2 svolge un ruolo fondamentale nel meccanismo apoptotico cellulare [37]. i membri della famiglia Bcl-2 sono coinvolti nei processi di morte cellulare; Bcl-2 è una proteina antiapoptotica e Bax mostra un'attività proapoptotica [37. 38]. Abbiamo studiato se gastrodin ha avuto un effetto sulla Bcl-2 e di espressione Bax in MPP + cellule - treated mediante analisi di espressione. Come mostrato in figura 4 (a). espressione di Bax è aumentato significativamente nel gruppo MPP + - treated rispetto a quella in cellule di controllo, che era coerente con gli studi precedenti [39. 40]. Tuttavia, il trattamento gastrodin soppressa espressione Bax mRNA in modo dose-dipendente. Al contrario, il livello di Bcl-2 nel MPP + gruppo - treated diminuito in modo significativo rispetto a quello in cellule di controllo, mentre la Bcl-2 ha recuperato dopo il trattamento gastrodin. Il rapporto Bax / Bcl-2 nelle cellule esposte a 1 e # x2009; mM MPP + aumentato volte rispetto a quella del gruppo di controllo, mentre il rapporto è diminuito in modo dose-dipendente in cellule pretrattate con 1, 5, e 25 & # x2009 ; & # X3bc; M gastrodin, suggerendo che gastrodin spostato la bilancia da parte dei membri pro e antiapoptotiche verso la sopravvivenza delle cellule. trattamento Gastrodin sola non ha alterato significativamente il rapporto Bax / Bcl-2 (Figura 4 (a)). Inoltre, abbiamo studiato se gastrodin ha avuto un effetto sulla Bax e l'espressione di Bcl-2 nei topi MPTP-intossicato utilizzando analisi di espressione. topi MPTP-intossicati hanno mostrato un aumento di espressione Bax sia nel corpo striato e SNPC, in accordo con un rapporto pubblicato in precedenza [41]. Tuttavia, il trattamento profilattico con gastrodin soppressa Bax espressione di mRNA nel SNPC e striato in modo dose-dipendente. Al contrario, il livello di Bcl-2 nei topi MPTP-intossicato diminuito in modo significativo rispetto a quello del gruppo di veicoli, ma il trattamento profilattico con gastrodin recuperato Bcl-2 dose-dipendente. Il rapporto Bax / Bcl-2 nei topi MPTP-intossicato aumentato significativamente (contro gruppo veicolo) rispetto a quella del gruppo del veicolo, mentre il trattamento profilattico con gastrodin attenuato il rapporto Bax / Bcl-2 in modo dose-dipendente (al 30 e 60 & # x2009; mg / kg) in SNPC (Figura 4 (c)) e (10 & # x2009; mg / kg, a 30 e 60 & # x2009; mg / kg) nello striato (figura 4 (d)) , suggerendo che il pretrattamento gastrodin spostato la bilancia da parte dei membri pro e antiapoptotiche verso la sopravvivenza delle cellule. Caspasi-3 è un biomarker cruciale di apoptosi neuronale che funge anche da un esecutore apoptotico [42]. Il trattamento con 1 & # x2009; mM MPP + notevolmente aumentato l'attività della caspasi-3, ma aggiungendo gastrodin attenuato MPP + indotta caspasi-3 espressione. e. rispettivamente in cellule SH-SY5Y in modo dose-dipendente (Figura 4 (b)). Inoltre, l'attività della caspasi-3 ha mostrato un marcato aumento del SNPC e striato di topi MPTP intossicato (e. Resp.). dose-dipendente pretrattamento Gastrodin attenuato MPTP indotto l'attività della caspasi-3 a. e. a 10, 30, e 60 e # x2009; mg / kg, rispettivamente, nel SNPC (figura 4 (e)) e. e. a 10, 30, e 60 e # x2009; mg / kg, rispettivamente, nello striato (Figura 4 (f)). Figura 4: Effetti della gastrodin su Bax e Bcl-2 espressione di mRNA e l'attività della caspasi-3 nelle cellule SH-SY5Y e tessuti animali trattati con MPTP. Bax e Bcl-2 livelli sono stati quantificati in cellule SH-SY5Y mediante analisi densitometrica (a) e nella substantia nigra pars compacta (SNPC) (c) e striato (d) con i rispettivi Bax / Bcl-2 rapporti. Gastrodin inibito il + MPP - e l'aumento MPTP indotta in caspasi-3 l'attività in cellule SH-SY5Y (b), SNPC (e), e nello striato (F), rispettivamente. I dati sono da tre esperimenti indipendenti eseguiti in triplice copia. I valori sono media & # xb1; errore standard (contro gruppo veicolo) e (. e contro MPP gruppo + / MPTP). 3.5. Gastrodin Sopprime MPP + / MPTP-Induced PARP proteolisi Caspasi-3 svolge un ruolo importante nella PARP scissione durante l'apoptosi precoce in molte linee cellulari differenti [43. 44]. Un precedente studio ha riportato che MPP + induce aumenti di PARP proteolisi a 48 & # x2009; h rispetto ai controlli culture [45]. PARP ad un x2009 85 & #; frammento kDa è stato rilevato utilizzando un anticorpo policlonale contro integrale PARP (116 & # x2009; kDa), e frammenti PARP spaccati (85 & # x2009; kDa). PARP proteolisi è stato migliorato in modo significativo dopo il trattamento con 1 & # x2009; mM MPP +. ma gastrodin concentrazioni di 1, 5, e 25 & # x2009; & # X3bc; M attenuato MPP + indotta PARP proteolisi in modo dose-dipendente (Figura 5 (a)). PARP scissione è un altro segno distintivo di apoptosi [44. 46]. 3.6. 4. Discussione Riferimenti vol. vol. vol. vol. vol. vol. vol. 77, no. vol. vol. vol. vol. vol. vol. vol. vol. vol. vol. vol. vol. vol. vol. vol. vol. 6, n. vol. vol. vol. vol. 6, n. vol. vol. vol. vol. vol. vol. vol. vol. vol. vol. vol. vol. vol. vol. vol. vol. vol. vol. . vol. vol. vol. vol. vol. vol. vol. vol. vol. vol. vol. vol. 19, no. vol. vol. 19, no. vol.
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